臨床生物化學/連續監測法與反應進程的分析

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臨床生物化學

血清酶定量的檢測技術
- 測定酶活性濃度的兩大類方法
  - 固定時間法（取樣法）
  - 連續監測法與反應進程的分析
  - 連續監測法測酶活性濃度
  - 酶活性的濃度單位
  - 連續監測法中的干擾因素及其控制

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從這個權威性的方法分類來看，前面所提到的二類測酶活性濃度方法都應歸納為動態法。目前廣為流行的“動態法”命名顯然是不確切的或者是不合適的。應該更多采用IFCC文件中建議的“連續監測法”命名。

從酶反應曲線來比較此二類方法。圖17-7是一個典型酶反應過程。

酶促反應中基質［S］、產物［P］

圖17-7　酶促反應中基質［S］、產物［P］

和反應速率V在不同時間變化的模式圖

在酶作用下，底物［S］濃度不斷下降，隨之有相應產物［P］產生。不少酶在反應一開始的階段，由于各種因素影響，反應速度較慢，稱為延滯期，隨后在過量濃度的底物存在條件下，酶反應以恒定的速度進行，不受底物濃度變化的影響，這段反應稱為線性反應期或零級反應期。隨時間延長，反應速度除與酶量有關，還與底物濃度有關。即v＝k(a－x)，式中a為原來底物濃度，x為消耗的底物濃度，如反應物濃度項上指數為1，稱為一級反應，假如反應速率受二種或二種以上物質濃度的影響，則各個反應物濃度項上指數總和作為反應級數，可以分別為一級、二級或多級反應，總的將這段反應時期稱為非線性反應期。

很明顯如測反應速度的目的是為了從此推算出酶含量的多少，則只有測線性反應期的反應速度才能作到此點。在延滯期、非線性期測的結果不準確，一般是偏低的。

取樣法由于方法學上的限制，一般只測二管：一為沒發生酶反應的對照管，另一管測酶作用一段時間后反應物的變化，實際上測得是平均速度，而且二管間隔時間都較長，在半小時左右，圖17-8中t₀，t分別代表不同時間二管反應物的量，雖然從t到t₀反應物變化量是相同的。但實際反應過程是多種多樣的。

只有當反應如曲線A時，用“固定時間法”才能測出真實的酶活性，實際工作中是很少見的，圖中曲線B代表了最常見的反應情況，在一個很短的線性反應期后在大部分測定期間內主要為非線性反應期。曲線C說明在測定期間包括了延滯期，曲線D則不僅包括了延滯期，還包括非線性期，在這些反應中如用固定時間法來測定，結果是不夠準確的，一般是偏低的，而且酶濃度愈高，偏離程度愈大。

假如從上節敘述中得出一個重要結論：即在設計和選擇測定酶活性濃度方法時必須是在“最適條件”下測定最大反應速度。那么從這段敘述中可得出一個對上述結論一個很重要的補充，即所測的最大反應速度還應該是初速度即V₀。

理論上的V₀在實際工作中是不存在的，必須讓酶和底物作用一段時間，消耗掉一定量的底物，才能測出反應速度，一般說，如消耗底物在5％內所測到的反應速度都可認為是初速度，如底物濃度很高時，底物消耗在20％以內的反應往往還在線性反應期。

連續監測法能滿足上述重要要求。由于不需停止酶反應。很容易得到整個酶反應曲線，然后根據反應曲線情況，避開延滯期和非線性反應期，只在線性反應期測定最大反應初速度。同時由于分光光度法的高靈敏度，自動生化分析儀的高精密度，連續監測法能在很短時間，甚至在1分鐘反應時間，準確測定反應速度，從而求出準確的酶活性濃度。“固定時間法”測定時間長達30分鐘，很難滿足上述方法學上測定初速度V₀的要求。

二點測定法中可能引起的誤差

圖17-8　二點測定法中可能引起的誤差

從理論上說，只有當測定的是初速度，米氏方程式才能成立，并可能測出真正的Km。用“固定時間法”測出的速度受到逆反應速度的影響。可以下式表示有逆向反應存在時的酶反應過程。

k1　k₂　k₃

E＋S→ES→EP→E＋P

←　←　←

K_－1　k_－2　k_－3

存在著EP和P時，就會出現逆反應，此時所測的為一表觀速度（Va）或反應的凈速度。

Va＝k₂［ES］－k_－2［EP］

［E］t代表酶總量，在反應過程中包含了游離酶［E］、酶底物復合物［ES］和酶產物復合物［］EP］。

Ks為［ES］的解離常數，Kp為［EP］的解離常數，故：

代入上式得：

根據Maldanc公式Keq＝VfKp/VrKs得：

在反應特定時間，產物［P］為一定值，上式得：

此公式從理論上說明，如所測反應有逆反應存在時，不存在原來的米-門方程式。用各種作圖法很難求出準確的米氏常數。如果說所測酶反應不僅存在著逆反應，產物還抑制了酶反應，則動力學公式將更為復雜。這就是為什么不僅在建立方法時，就是在研究酶的動力學時，也總是希望所測量的都是酶反應的初速度。

以上這二類方法并不是概括了所有測酶活性濃度的方法，也并不排除在非線性反應期測酶活性濃度的可能性。如固定底物變化量，則不同標本達到此變化終點的時間，與酶量成反比例，Somogyi曾提出一種測淀粉酶的方法，酶與底物混合后。每隔半分鐘取一滴出來加入碘液呈色，觀察顏色由紫色變為紅色時間，也就是淀粉酶全部水介變為糊精的時間，并由此時間的長短計算出酶含量高低，這類方法不需使用很高濃度的底物，有其獨特之外，在自動生化分析儀中也曾使用類似的方法，值得人們重視。