基因診斷與性病/核酸探針的種類

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基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病
- 核酸分子雜交法
  - 核酸探針的種類
  - 核酸探針的標記和檢測
  - 核酸分子雜交方法

DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現已獲的DNA探針種類很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細菌的毒力因子基因探針和人類ALU探針，這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術的發展和應用。以細菌為例，目前分子雜交技術用于細菌的分類和菌種鑒定比用G+C百分比值要準確的多，是細菌分類學的一個發展方向，加之分子雜交技術的高度敏感性，分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。

DNA探針（包括cDNA探針）有三大優點：第一，這類探針多克隆在質粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。其次，DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機引物法、PCR標記法等，能用于同位素和非同位素標記。

（二）cDNA探針

cDNA是指互補于mRNA的DNA分子（complementary DNA）。cDNA是由RNA經一種稱為逆轉錄酶的DNA聚合酶催化產生的。攜帶逆轉錄酶的病毒侵入宿主細胞后，病毒RNA在逆轉錄酶的催化下轉化成雙鏈cDNA，并進而整合入宿主細胞染色體DNA分子，隨宿主細胞DNA復制同時復制，這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止狀態下，可被復制多代，但不被表達，故無毒性，一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復制。如其帶有癌基因，還可能誘發細胞癌變。

逆轉錄現在已成為一項重要的分子生物學技術，廣泛用于基因的克隆和表達。從逆轉錄病毒中提取的逆轉錄酶也已商品化。最常用的有AMV逆轉錄酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物，在逆轉錄酶催化下合成互補于mRNA的cDNA鏈，然后再用RNaseH將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉錄過程。

所得到的雙鏈cDNA分子經S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭(Adapter),再經特定限制酶消化產生粘性末端，即可與含互補末端的載體進行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt、EMBL和Charon 系列等。用這類載體可以得到包含105以上轉化子文庫，再經前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術獲得的DNA探針不含有內含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。

（三）RNA探針

RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應效率極高。早期采用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細胞基因轉錄或病毒復制過程中得到標記的，標記效率往往不高，且受多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。例如，在篩選逆轉錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組DNA克隆時，因無DNA探針可利用，獲得HIV的全套標記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。

隨著體外逆轉錄技術不斷完善，已成功的建立了單向和雙向體外轉錄系統。該系統主要基于一類新型載體PSP和PGEM，這類載體在多克隆位點兩側分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可進行RNA轉錄。如果在多克隆位點接頭中插入了外源DNA片段，則可以以DNA兩條鏈中的一條為模板轉錄生成RNA。這種體外轉錄反應效率很高，在1小時內可合成近10μg的RNA產物。只要在底物中加入適量的放射性或生物素標記的dUTP，則所合成的RNA可得高效標記。該方法能有效地控制探針的長度并可提高標記分子的利用率。

RNA探針和cDNA探針具有DNA探針所不能比擬的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標記方法復雜等缺點。

（四）寡核苷酸探針

前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進行克隆以便繪制酶譜和測序時，也常應用克隆探針。克隆探針一般較寡核苷酸探針的特異性強，復雜度也高，從統計學角度而言，較長的序列隨機碰撞互補序列的機會較短序列少。克隆探針的另一優點是，可獲得較強的雜交信號，因為克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標記基因更多。但是，較長的探針對于靶序列變異的識別能力又有所降低。對于僅是單個堿基或少數堿基不配的兩個序列，克隆探針不能區分，往往雜交信號相當。這既是其優點，又是其缺點，優點是當用于檢測病原微生物時，不會因病毒或細菌DNA的少許變異而漏診，缺點則是不能用于檢測突變點。這種情況，通常要采用化學合成的寡核苷酸探針。

合成的寡核苷酸探針具有以下特點：第一，由于鏈短，其序列復雜度低，分子量小，所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短。第二，寡核苷酸探針可識別靶序列內一個堿基的變化，因為短探針中堿基錯配能大幅度降低雜交體的Tm值。第三，一次可大量合成寡核苷酸探針，使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學或化學方法修飾以進行非放射性標記物的標記。最常用的寡核苷酸探針長18-40個鹼基，目前的合成可有效地合成至少50個堿基的探針。

對于合成的寡核苷酸探針有以下要求：

（1）長度以18-50堿基為宜，較長探針雜交時間較長，合成量也低；較短探針特異性較差。

（2）堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。

（3）探針分子內不應存在互補區，否則會出現抑制探針雜交的“發夾”狀結構。

（4）避免單一堿基的重復出現。

（5）一旦選定某一序列符合上述標準，最好將該序列與核酸庫中的核酸序列比較，探針序列應與靶序列核酸雜交，而與非靶區域的同源性不應超過70%或有連續8個或更多的堿基的同源。否則，該探針不能用。